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Nature Methods:高质量的组蛋白PTM抗体
发布时间:2013-08-30        浏览次数:1117        返回列表

生物通报道 美国芝加哥大学的研究人员开发出质量稳定的重组抗体,能特异识别组蛋白H3的三甲基赖氨酸残基,适合各种表观遗传学应用。这一成果于近日发表在《Nature Methods》在线版上。
组蛋白的翻译后修饰(PTM)在表观遗传调控中发挥重要作用。组蛋白PTM的抗体是表观遗传学研究(如染色质免疫沉淀(ChIP)、免疫染色和免疫印迹)中的关键元素。然而,许多抗体不能特异识别预定目标。此外,目前的组蛋白抗体以多克隆抗体居多,因此每一批抗体都是不同的产品,在使用前需要广泛验证。
事实上,组蛋白的翻译后修饰是极具挑战性的抗体识别靶点,因为各个修饰之间的化学差异很小,特别是甲基化状态之间,并且不同修饰位点周围的序列相似度高。而且,很难实现与灵活肽段的高亲和力,如组蛋白的尾巴,因为结合时会有熵损失。因此,难以产生高质量的抗体并不出人意料。
为了解决这一“抗体瓶颈”,芝加哥大学生物化学与分子生物学系的研究人员开始了他们的探索。他们首先发现了一个单链Fc克隆(scFv4-5),它能高度特异地与三甲基赖氨酸结合,但亲和力和序列特异性低。为了改善结合功能,他们利用突变法鉴定出对识别三甲基赖氨酸很重要的位置。随后利用突变数据设计出定制的噬菌体展示库,并根据结合情况排序。他们发现了一个克隆(309M3-A),与H3K9me3的解离常数为24 nM,与scFv4-5相比有80倍的改善,而且几乎不与其他肽段结合,展示出高亲和力和高特异性。它的批间差异也很小。
除了H3K9me3的抗体,研究人员还开发出H3K4me3的抗体。这个克隆被称为304M3-A,与H3K4me3的解离常数为16 nM,且特异性高,批间差异小。由于ChIP可以说是组蛋白PTM抗体的最重要应用,研究人员在ChIP实验中检验了这些重组抗体。结果表明,利用309M3-A和304M3-A的实验分别富集了带有H3K9me3和H3K4me3的特定位点。相比之下,阴性对照抗体未富集到任一位点,说明了抗体结合的低背景。
作者认为,重组抗体的可再生性质让研究人员不再需要评估每个抗体。重组抗体也能改造成不同的形式,适用于特定应用。总之,组蛋白翻译后修饰的重组抗体不仅大大加速并改善了表观遗传学研究,还有望实现新的研究。      来源:生物通